摘要：目的運(yùn)用超分子印跡模板作用規(guī)律對金銀花和山銀花體外印跡等效性進(jìn)行研究，旨在為金銀花和山銀花兩花紛爭提供新的解決方法。方法以金銀花藥渣、山銀花藥渣、菊花藥渣為主體分子，以金銀花、山銀花、雙黃連（金銀花）、雙黃連（山銀花）、銀翹散（金銀花）、銀翹散（山銀花）水提液為客體分子，3種主體分子和6種客體分子進(jìn)行選擇性吸附。采用HPLC法對吸附前后的客體分子水溶液指紋圖譜進(jìn)行測定。運(yùn)用總量統(tǒng)計矩法計算總量一階矩及其差值，并對差值進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果6種客體分子分別被金銀花與山銀花主體分子組、金銀花與菊花主體分子組、山銀花與菊花主體分子組吸附后，其總量一階矩差值經(jīng)t檢驗(yàn)，P1＝0.94＞0.05、P2＝0.02＜0.05、P3＝0.04＜0.05。所有客體分子分別被金、山銀花主體分子吸附后，其總量一階矩差值無顯著性差異。而被菊花主體分子吸附后，與被金銀花和山銀花主體分子吸附后相比均存在顯著性差異。結(jié)論金銀花和山銀花之間印跡模板具有相似性，而金銀花和山銀花與菊花之間印跡模板存在差異。說明金銀花和山銀花二者存在印跡等效性，這也與臨床用藥相符合。
“印跡等效性”是指二者具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)而體現(xiàn)相同（似）“印跡模板”作用規(guī)律的現(xiàn)象，臨床上則表現(xiàn)為異質(zhì)等效，即不同物質(zhì)產(chǎn)生相同作用效果的現(xiàn)象。金銀花和山銀花在我國資源豐富，藥用歷史悠久。二者原同屬金銀花，《中國藥典》2005年版將其分列。至此，南北“兩花”紛爭開始上演，紛爭表象看似是正本清源，然實(shí)質(zhì)卻是中藥異質(zhì)等效規(guī)律的求證。
金銀花主產(chǎn)于山東、河南等北方種植區(qū)，山銀花主要分布在湖南、四川、廣東等南方種植區(qū)[1]，且二者的外觀性狀也存在較大區(qū)別[2-3]。除此以外，金銀花和山銀花物質(zhì)成分種類及含量亦不盡相同，從現(xiàn)有文獻(xiàn)統(tǒng)計，在化學(xué)成分組成方面，金銀花較山銀花含有更豐富的環(huán)烯醚萜類和黃酮類化合物，山銀花較金銀花含有更為豐富的三萜皂苷類化合物。在各類化學(xué)成分含量方面也存在明顯差異[4-16]，山銀花中綠原酸類化合物含量明顯高于金銀花，金銀花中木犀草苷、蘆丁、忍冬苷、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷含量遠(yuǎn)高于山銀花。例如，山東平邑金銀花中木犀草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.073 9%，而湖南懷化的山銀花中沒有檢測到木犀草苷，重慶秀山的山銀花綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)9.03%，遠(yuǎn)高于山東平邑金銀花中綠原酸4.08%的含量[17-18]。在微量元素方面，金銀花中鐵（Fe）與鎳（Ni）含量高于山銀花，而山銀花中錳（Mn）含量高于金銀花[19]。盡管金、山銀花在地域分布、外觀形態(tài)、藥效物質(zhì)種類和含量上存在差異，但兩者在性味與歸經(jīng)、功能與主治甚至用法與用量中均為一致，這點(diǎn)在中醫(yī)臨床長期實(shí)踐過程及藥典中可得到充分證實(shí)[20]。然而為何會產(chǎn)生這種現(xiàn)象，為何擁有不同種類、不同數(shù)量化學(xué)成分的2味中藥，在臨床上卻能產(chǎn)生相同的治療效果。不難看出，金銀花和山銀花的藥理作用除了遵循傳統(tǒng)的藥理學(xué)作用規(guī)律外，還應(yīng)有特殊作用規(guī)律即異質(zhì)等效規(guī)律，也就是中藥多成分所產(chǎn)生的藥理綜合作用是諸成分印跡模板對人體印跡作用的結(jié)果，具體可用超分子印跡模板理論來闡明。
印跡模板理念來源于Fischer酶與底物作用的鎖鑰模型以及Pauling的抗體形成學(xué)說，類似于藥理學(xué)經(jīng)典的受體-配體理論，能夠用于解釋受體-配體理論。但與其又存在差異，是指以特定模板分子為客體分子，尋找及制備出對該客體分子具有特異選擇性主體分子的過程，屬于超分子化學(xué)中主客體化學(xué)研究范疇，能體現(xiàn)自組織、自組裝、自識別與自復(fù)制的特點(diǎn)[21-27]。超分子印跡模板概念是化學(xué)上的分子結(jié)構(gòu)概念，是在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上能完全匹配的模板物，對中藥成分來說既是其分子結(jié)構(gòu)的空間活性結(jié)構(gòu)，也可以說是活性原子團(tuán)的空間排列點(diǎn)陣，能從化學(xué)物質(zhì)的本源上說明主客體分子（在一定程度下是受體-配體理論）的普遍作用規(guī)律。例如，哌替啶、嗎啡、美沙酮、噴他佐辛、芬太尼等均可與腦啡肽競爭性結(jié)合作用于大腦阿片受體，起到同樣的中樞鎮(zhèn)痛作用，然而這眾多鎮(zhèn)痛藥的結(jié)構(gòu)與腦啡肽的結(jié)構(gòu)相差千里[28]。這就說明產(chǎn)生同樣的藥理作用可以是不同的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此單用受體-配體、結(jié)構(gòu)-配體理論不能做深層次解析，自然只能將嗎啡肽受體的3點(diǎn)結(jié)合抽象成印跡模板的空間結(jié)構(gòu)表達(dá)。且大量的生物超分子化學(xué)表明，來源于動植物的中藥是一個巨大的超分子體系，是自然界分子社會按印跡模板自主作用的結(jié)果[29]。因此，對于金銀花和山銀花的異質(zhì)等效現(xiàn)象只能用高于經(jīng)典的構(gòu)效關(guān)系的超分子印跡模板理論來闡述其所在核心之所在：不同物質(zhì)可以相同印跡模板作用于相一致印跡模板的病證，而這種印跡模板的作用特征可以通過體外的印跡交叉實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。
1實(shí)驗(yàn)原理
基于中藥超分子理論，中藥主客體分子的分離實(shí)質(zhì)即從巨復(fù)的中藥超分子體系中洗脫模板小分子保留母體印跡模板的過程，包括中藥成分提取和溶出。因此，通過對金銀花和山銀花成分的充分提取和溶出即可實(shí)現(xiàn)其超分子主客體分子分離的過程。本實(shí)驗(yàn)在對金銀花和山銀花主客體分子進(jìn)行分離后，可得到藥渣（主體分子）及金銀花和山銀花提取液（客體分子）。因菊花以花入藥，且具有清熱解毒的作用，所以其藥渣被選為本實(shí)驗(yàn)的陰性對照。同時在金銀花、山銀花單味藥的基礎(chǔ)上增加了雙黃連與銀翹散處方，選其水提取液參與實(shí)驗(yàn)。為驗(yàn)證金銀花和山銀花印跡等效性，探討主體分子對客體分子的選擇吸附性，使金銀花、山銀花、菊花藥渣與金銀花、山銀花、雙黃連（金銀花）、雙黃連（山銀花）、銀翹散（金銀花）、銀翹散（金銀花）水提液進(jìn)行選擇性吸附，再采用HPLC法測定吸附前后水提液的指紋圖譜。
統(tǒng)計矩原理為非房室模型分析方法，可通過總量零階矩（AUC）、總量一階矩（MRT）、總量二階矩（VRT）對中藥及其復(fù)方指紋圖譜進(jìn)行分析。其中零階矩表示血藥濃度-時間曲線下面積，即整個指紋圖譜的峰面積和；一階矩為平均駐留時間，即整個指紋圖譜所有峰重心的位置；二階矩為平均駐留時間的方差，即指紋圖譜中每個峰與峰重心的距離。較之其他指紋圖譜分析方法，該法具有抗干擾性、加和性、偶聯(lián)性的特點(diǎn)[30-32]。一直以來，本團(tuán)隊(duì)致力于將總量統(tǒng)計矩法運(yùn)用于中藥及其復(fù)方的指紋圖譜分析中，也取得了較好的成效。賀福元等[33]采用HPLC法對不同產(chǎn)地大黃指紋圖譜進(jìn)行測定，運(yùn)用總量統(tǒng)計矩法對其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)通過一階矩可以定性識別大黃；胡超等[34]通過總量統(tǒng)計矩法對不同批次片仔癀指紋圖譜進(jìn)行分析，所建立的片仔癀指紋圖譜重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、特征性強(qiáng)。除此以外，楊巖濤等[35]、周晉等[36-37]、謝相貴等[38]也對其進(jìn)行了研究，證實(shí)了該法可對中藥及其復(fù)方指紋圖譜進(jìn)行定性定量分析，準(zhǔn)確度較好。
本實(shí)驗(yàn)通過計算實(shí)驗(yàn)后所有指紋圖譜一階矩、原客體分子與被不同主體分子吸附后相應(yīng)客體分子指紋圖譜一階矩差值，比較相同客體分子被不同主體分子吸附后其指紋圖譜的變化情況。以此來探討3種主體分子是否存在相同印跡模板，從而對金銀花和山銀花的印跡模板等效性進(jìn)行評價。
2試藥與儀器
2.1試藥與試劑
金銀花LoniceraeJaponicae Flos（忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花）、菊花Chrysanthemi Flos（菊科菊屬植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序）、雙黃連處方［金銀花、黃芩Scutellariae Radix（唇形科黃芩屬植物黃芩Scutellariabaicalensis Georgi的干燥根）、連翹Forsythiae Fructus（木犀科連翹屬植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實(shí)）］、銀翹散處方［金銀花、連翹、薄荷Menthae Haplocalycis Herba（唇形科薄荷屬植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分）、荊芥Schizonepetae Herba（荊芥Schizonepeta tenuifoliaBriq.的干燥地上部分）、淡豆豉Sojae Semen Praeparatum（豆科大豆屬植物大豆Glycine max(L.)Merr.的成熟種子的發(fā)酵加工品）、牛蒡子Arctii Fructus（菊科牛蒡?qū)僦参锱］駻rctium lappa L.的干燥成熟果實(shí)）、桔梗Platycodonis Radix（桔�？平酃僦参锝酃latycodongrandiflorus(Jacq.)A.DC.的干燥根）、淡竹葉Lophatheri Herba（禾本科淡竹葉屬植物淡竹葉Lophatherumgracile Brongn.的干燥莖葉）］。以上藥材及處方中藥材均委托湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科定點(diǎn)采購，山銀花Lonicerae Flos（灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.的干燥花蕾或帶初開的花）購于湖南省隆回縣，并由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室石繼連副教授按《中國藥典》2015年版一部有關(guān)項(xiàng)下進(jìn)行鑒別，結(jié)果均為正品。乙腈為色譜純，水為自制超純水。
2.2儀器
Waters1525 BinaryHPLC Pump、Waters2489UV/Visible Detector、Breeze工作站，美國Waters公司；RE-200B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SHB-IIIAS型循環(huán)水式真空泵、ZDHW型調(diào)溫電熱套，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；YP-B10001型電子天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；DFY-400搖擺式高速中藥粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SK3300H型超聲清洗器，上海科尋超聲儀器有限公司；TS-A脫色搖床，金壇市中大儀器廠；移液槍，雪蓓醫(yī)療設(shè)備有限公司。
3方法
3.1色譜條件
色譜柱為Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為0.4%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～5 min，5%～8%乙腈；5～25 min，8%～20%乙腈；25～35 min，20%～22%乙腈；35～45 min，22%～30%乙腈；45～50 min，30%～36%乙腈；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10μL；檢測波長238 nm；柱溫30℃。各成分理論塔